一、研究背景

骨组织具备天然的再生能力，但再生过程受扰会引发骨相关疾病，目前临床常用骨移植物治疗骨缺损，却存在供体部位发病率高、免疫排斥等问题，限制了其应用。骨组织工程的核心是制备模拟天然骨结构和功能的支架，而现有支架普遍存在血管化不足、愈合能力有限的缺陷。

甲基纤维素（MC）是水溶性纤维素衍生物，具有温敏凝胶特性，但其缺乏哺乳动物细胞黏附基序；明胶（GEL）源自胶原蛋白，含RGD肽序列，可支持细胞黏附，二者复合能互补优势，提升支架的成型性和细胞相容性。六角氮化硼（h-BN）因化学稳定性、生物活性和良好的生物相容性，成为骨组织工程的潜力材料，前期研究表明其可提升生物材料的机械强度、成骨分化能力，还具备一定的抑菌活性，但将h-BN与GEL/MC复合制备3D打印骨支架的研究尚未深入。

基于此，本研究将不同浓度h-BN纳米片引入GEL/MC体系，制备3D打印支架，旨在开发兼具抗菌性、生物活性、结构稳定性的骨移植物，解决传统骨支架感染风险高、成骨能力不足等问题。

二、研究内容

本研究以明胶（GEL）、甲基纤维素（MC）为基材，添加0、1、3、5、10 wt.%的六角氮化硼（h-BN）纳米片制备水凝胶墨水，通过直写式（DIW）3D打印机制备支架并经EDC/NHS化学交联，系统表征了支架的流变学、化学结构、微观形貌、力学性能、降解行为等理化性质，同时通过体外实验评估其生物矿化、细胞相容性、成骨分化及抗菌性能，探究h-BN含量对支架性能的调控规律及作用机制。核心研究内容分为以下8部分：

1. h-BN纳米片的表征

图1 (a) h-BN纳米片的SEM图像（标尺：500 nm，n=100）；(b) h-BN纳米片的粒径分布；(c) h-BN纳米片的傅里叶变换红外（FTIR）光谱

h-BN纳米片为不规则六角片状结构，粒径主要分布在110~150 nm，平均粒径约158 nm；FTIR光谱在1301 cm⁻¹（B-N共价键伸缩振动）和756 cm⁻¹（六角环中B-N面外弯曲振动）出现特征吸收峰，证实了h-BN的结构特征。

2. 水凝胶墨水的流变学性能

图2 GEL/MC/BN水凝胶的流变学性能：(a) 振幅扫描；(b) 频率扫描；(c) 剪切速率相关黏度；(d) 随温度变化的复合黏度；(e) 温度扫描分析

所有水凝胶的储能模量（G’）均高于损耗模量（G”），呈典型的弹性凝胶特征；1 wt.% h-BN可提高G’，但更高浓度会因颗粒团聚降低储能模量并缩小线性黏弹区；水凝胶均表现出剪切稀化特性，适合挤出式3D打印；MC的温敏凝胶特性使水凝胶黏度随温度升高显著增加，1%、3% h-BN可增强凝胶强化效应，5% h-BN因团聚无此效果。

3. 支架的化学结构与3D打印性能

图3 (a) GEL/MC/BN支架的3D打印制备流程；(b) GEL、MC、GEL20MC10及GEL20MC10BN5支架的FTIR光谱

图4 (a) GEL20MC10BN支架的光学图像和明场图像（标尺：2 mm、200 µm）；(b) 水凝胶墨水的可打印性分析；(c) 支架孔径对比；(d) 支架杆径对比（ns：无显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001 vs GEL20MC10，n=5）

FTIR光谱证实GEL与MC间存在氢键相互作用，h-BN的引入使光谱出现B-N基团振动峰，表明h-BN成功掺入并与GEL/MC体系发生相互作用；所有支架均呈现规则的方孔晶格结构，可打印性良好，h-BN的加入使支架孔径从924 µm降至691 µm，杆径从0.29增至1.06，形成更致密的结构且保持良好的成型精度。

4. 支架的力学性能

图5 GEL20MC10基支架的力学分析：(a) 应力-应变曲线；(b) 抗压强度；(c) 压缩模量；(d) 极限抗压强度下的应变率（ns：无显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001 vs GEL20MC10，n=5）

纯GEL20MC10支架的抗压强度最高（约0.86 MPa），h-BN的加入使抗压强度略有下降（0.58~0.60 MPa），但压缩模量（0.12~0.13 MPa）无显著变化，极限抗压应变率也保持在76%~101%，说明h-BN的引入未显著改变支架的刚度和延展性，仍保持良好的机械柔性和稳定性。

5. 支架的降解与溶胀行为

图6 (a) GEL20MC10基支架的吸水率；(b) 不同时间点的剩余重量；(c) PBS中的pH变化；(d) 第42天的支架数码照片（标尺：5 mm），n=3

h-BN的疏水特性可降低水的渗透，提升支架的结构稳定性：5%、3% h-BN支架在42天时剩余重量分别超70%、约68%，而纯支架和1% h-BN支架仅剩余44.5%、39.5%；高浓度h-BN支架的吸水率更稳定，且降解过程中支架浸泡液的pH始终维持在6.5~7.36的生理范围内，无明显酸碱偏移。

6. 支架的生物矿化性能

图7 (a-d) SBF处理7天后GEL20MC10、GEL20MC10BN1、GEL20MC10BN3、GEL20MC10BN5复合材料的SEM图像；(e) SBF处理7天支架的FTIR光谱（*：磷灰石峰）；(f) 第7天SEM-EDS分析的Ca/P比；(g) h-BN纳米片表面磷灰石沉积的相互作用机制示意图；(h) SBF处理14天支架的FTIR光谱（*：磷灰石峰）

h-BN在模拟体液（SBF）中带负电，为磷酸钙沉积提供成核位点，显著触发磷灰石形成：纯支架Ca/P比仅0.8，而h-BN复合支架Ca/P比均超1.67；SEM显示h-BN浓度越高，支架表面磷灰石簇越致密，FTIR在1030~1050 cm⁻¹出现磷灰石特征峰，证实h-BN可显著提升支架的生物矿化能力，且矿化程度随h-BN浓度增加而增强。

7. 支架的细胞相容性与成骨分化能力

图8 (a) GEL20MC10基支架的接触角值；(b) 支架表面水滴的数码照片（p<0.01 vs GEL20MC10，n=3）；(c) 培养3、7天后MC3T3-E1细胞在支架上的存活率（ns：无显著性差异，*p<0.05）

图9 MC3T3-E1前成骨细胞的茜素红S染色：(a) GEL20MC10基支架的染色图像（标尺：5 mm）；(b) 支架上细胞染色的定量分析，n=3（****p<0.0001）

1% h-BN使支架接触角从45°降至35°（亲水性提升），更高浓度h-BN则使支架向疏水性转变（5% h-BN接触角52°）；所有h-BN复合支架均支持MC3T3-E1前成骨细胞的存活和增殖，第7天细胞存活率达86%以上，无明显细胞毒性；茜素红染色显示，h-BN的引入可浓度依赖性地促进细胞钙沉积，5% h-BN支架的矿化程度最显著，证实其可有效诱导成骨分化。

8. 支架的抗菌性能

图10 对数减少率（LR）和杀菌率（% Kill）的图示，n=3（***p<0.001）

支架的抗菌性具有**物种特异性**：≥5 wt.% h-BN的支架对革兰氏阴性菌（大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa）表现出显著的杀菌效果，4 h内对大肠杆菌的对数减少率达5.91（5% h-BN）、7.68（10% h-BN），对铜绿假单胞菌达3.55（5% h-BN）、4.08（10% h-BN）；但对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌S.aureus）无明显抗菌活性。该特异性与细菌细胞壁结构差异及h-BN与GEL/MC基质的相互作用相关。

9. 实验方法与材料

本研究采用Sigma–Aldrich的h-BN纳米片、明胶（牛皮Type B）、甲基纤维素（黏度15 cP）为原料，按表1制备水凝胶墨水，通过Axolotl Biosystem A1生物3D打印机制备支架，打印参数如表2；采用SEM、FTIR、流变仪、万能试验机等表征材料结构与性能，以MC3T3-E1前成骨细胞评估生物相容性，以E.coli、S.aureus、P.aeruginosa为模式菌开展抗菌实验，所有数据采用GraphPad Prism和IBM SPSS进行统计分析（p<0.05为有显著性差异）。

三、研究结论

• 成功制备了h-BN复合GEL/MC的3D打印支架，h-BN可与GEL/MC体系发生分子间相互作用，且水凝胶墨水的剪切稀化特性保证了良好的挤出式3D打印性，支架成型精度高、孔结构规则。
• h-BN的引入虽使支架抗压强度略有下降，但保持了压缩模量和延展性不变，同时其疏水特性显著提升了支架的结构稳定性，降低了降解速率，且降解过程中无明显pH偏移，符合生理环境要求。
• h-BN在SBF中带负电，为磷酸钙沉积提供成核位点，可浓度依赖性地触发磷灰石形成，显著提升支架的生物矿化能力；同时h-BN复合支架无明显细胞毒性，可支持成骨细胞存活增殖，并有效诱导细胞成骨分化。
• ≥5 wt.% h-BN的支架对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌）表现出显著的杀菌效果，具有物种特异性抗菌活性，可降低骨植入后的感染风险。
• h-BN是骨组织工程支架的优良改性添加剂，GEL/MC/h-BN 3D打印支架兼具**结构稳定性、生物活性、细胞相容性和抗菌性**，是抗感染骨移植物的潜在候选材料，为骨组织工程支架的多功能设计提供了新策略。

研究同时指出，后续需进一步优化h-BN的表面改性和添加浓度，提升支架的机械强度，并深入探究h-BN调控成骨分化和抗菌性的分子机制，为其临床转化奠定基础。

四、论文基础信息